一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体gva-p21及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术应用领域，特别涉及一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体gva-p21及其应用。
背景技术：2.随着海水养殖产业的迅速发展和集约化养殖规模的不断扩大，海水养殖业中细菌性疾病的发病率越来越高。在导致水产养殖动物感染的病原菌中，致病性弧菌占有较高的例，这不仅给水产动物健康带来高风险，也给海水养殖产业造成严重的经济损失。
3.常见的水产动物致病性弧菌主要有鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌，其中，溶藻弧菌的数量居海洋弧菌之首，其引起的弧菌病具有发病率高、死亡率高、流行范围广等特点。溶藻弧菌可引起人的伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病，又可引起鱼、虾、贝等海水养殖动物的弧菌病爆发，尤其是夏季，溶藻弧菌病的爆发常造成水产养殖业巨大的经济损失。目前针对水产养殖相关的弧菌病主要采用抗生素治疗为主，但是，随着抗生素的滥用，越来越多的病原弧菌产生耐药性，使得病原菌的耐药性问题愈发严重。
4.噬菌体是指感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，其结构简单，特异性强，能高效裂解宿主病原菌；溶藻弧菌噬菌体能有效裂解溶藻弧菌，在水产养殖预防和治疗上具有非常巨大的优势和潜力。
5.本发明通过筛选得到的溶藻弧菌噬菌体gva-p21，通过研究其生物学特性，为溶藻弧菌的生物控制提供新的方法。
技术实现要素：6.本发明的目的之一是提供一株溶藻弧菌噬菌体(vibrio alginolyticus phage)；
7.本发明的目的之二是将所述的溶藻弧菌噬菌体(vibrio alginolyticus phage)应用于抑菌。
8.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
9.申请人在广东湛江某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体gva-p21，所述噬菌体在2021年11月23日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学；保藏编号为cctcc no：m 20211480，命名为gva-p21。
10.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
11.本发明所述溶藻弧菌噬菌体gva-p21具有高发酵率，在最佳感染复数moi＝0.01时，发酵6h，效价可达8.24
×
10
10
pfu/ml，对工业发酵提供了理论数据。
12.本发明所述溶藻弧菌噬菌体gva-p21具有较宽裂解谱，对355株溶藻弧菌中的339株具有裂解效果，裂解率达95.5％，对溶藻弧菌的预防与治疗提供了优异的治疗资源与方法。
13.本发明所述溶藻弧菌噬菌体gva-p21具有优秀的抑菌表现，抑菌时长可达24h，与其它噬菌体相比，具有明显、直观的抑菌效果，在24h时，噬菌体gva-p21将溶藻弧菌od
600
控
制在0.20以内，噬菌体vapl1组的溶藻弧菌od
600
到达1.1，浓度相差5倍。
14.本发明能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源和安全、无毒副作用、特异性强且可大规模发酵生产的生物防控措施。
附图说明
15.图1为本发明溶藻弧菌噬菌体gva-p21噬菌斑；
16.图2为本发明溶藻弧菌噬菌体gva-p21电镜图；
17.图3为本发明不同感染复数下溶藻弧菌噬菌体gva-p21的效价；
18.图4为本发明反应不同时间后溶藻弧菌噬菌体gva-p21的ph值稳定性；
19.图5为溶藻弧菌噬菌体gva-p21于不同温度下存放不同时间后的效价；
20.图6为溶藻弧菌噬菌体gva-p21的工业发酵动态；
21.图7为溶藻弧菌噬菌体gva-p21与vapl1溶藻弧菌的动态抑菌结果。
具体实施方式
22.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
23.实施例1：
24.溶藻弧菌噬菌体gva-p21的分离纯化
25.在广东湛江某水产养殖水塘采集水样3份，每份50ml，6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，取5ml处理后上清液与0.5ml溶藻弧菌(浓度为5
×
108cfu/ml左右)混合均匀，静止吸附15min后，放置于28℃培养箱中150rpm/min振荡发酵培养过夜；取发酵后液体6000rpm/min离心10min，取上清，并用0.22μm滤器除菌，得种子滤液，取滤液100μl与300μl溶藻弧菌(浓度为5
×
108cfu/ml左右)混合均匀，静止吸附15min后，将混合物与2％氯化钠tsb半固体(含0.65％琼脂)混合均匀，浇筑在2％氯化钠tsa底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。记录培养皿噬菌体的效价，在培养皿上挑取噬菌斑透而亮的斑点，于1mlsm液中振荡解吸附后过0.22um的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5ml2％氯化钠tsb液体培养基中，加入100ul相应的宿主溶藻弧菌菌液并混匀，静止吸附15min，37℃下150rpm/min过夜培养，5000rpm/min离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
26.从水样中分离到两株溶藻弧菌噬菌体，分别是gva-p21与vapl1。噬菌体gva-p21与宿主菌形成圆形透亮的噬菌斑，直径为1mm。该噬菌体gva-p21已于2021年11月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，命名为溶藻弧菌噬菌体(vibrio alginolyticus phage)gva-p21，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：cctcc no：m 20211480。
27.实施例2：
28.溶藻弧菌噬菌体gva-p21对溶藻弧菌裂解范围实验
29.采用双层点滴法来测定噬菌体的裂解谱。准备好足量的盛有3ml的2％氯化钠tsb的ep管，355株溶藻弧菌接种于该培养基中，37℃恒温200rpm/min振荡7h，得到355份溶藻弧菌菌液；准备好足量的tsa底板，将0.9ml溶藻弧菌菌液与50℃左右的6mltsb半固体培养基(含0.65％琼脂)混合均匀，缓慢平铺于tsa底板之上；待平板培养基凝固至常温后，取溶藻
弧菌噬菌体gva-p21溶液(效价1
×
109pfu/ml)7μl滴于双层板中心，等溶液自然风干后，放置于37℃恒温生化培养箱中培养7h左右，观察结果。每组实验重复3次。
30.结果如表所示，溶藻弧菌噬菌体gva-p21具有高裂解率，在355株溶藻弧菌裂解实验中，能裂解其中339株，裂解率达95.5％，说明溶藻弧菌噬菌体gva-p21裂解谱较宽，在水产养殖中溶藻弧菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力。
31.表1 溶藻弧菌噬菌体gva-p21的裂解谱实验结果
32.33.34.35.36.[0037][0038]
注：++：表示完全裂解，噬菌斑透亮；+：表示完全裂解，噬菌斑较透亮；+：表示未裂解。
[0039]
实施例3：
[0040]
不同感染复数及不同感染时间下溶藻弧菌噬菌体gva-p21的效价测定
[0041]
准备溶藻弧菌噬菌体gva-p21的宿主菌溶藻弧菌gva1，准备好装有3ml2％氯化钠tsb的ep管，挑取溶藻弧菌vajs1单菌落接种于培养基中，在37℃条件下振荡培养8h，得到宿主菌菌液。按接种量1％接种菌液至100ml tsb培养基中，待溶藻弧菌生长至对数初始期时(浓度1
×
107cfu/ml)，随后将溶藻弧菌噬菌体gva-p21接种于该培养基中，按照不同的感染复数(multiplicity of infection，moi；moi＝噬菌体数量/细菌数量)，每组实验3个平行。在28℃摇床中150rpm振荡培养12h。每2h取出部分培养液进行8000rpm/min离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，12h后结束培养。
[0042]
实验结果如图3所示，在moi＝0.01时，发酵6h，效价最高，为8.24
×
10
10
pfu/ml，对工业发酵提供了理论基础。
[0043]
实施例4
[0044]
溶藻弧菌噬菌体gva-p21的ph稳定性试验
[0045]
取无菌细菌瓶分别加入不同ph(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的2％氯化钠tsb培养基9ml后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lml噬菌体纯培养液(起始效价：3.57
×
108pfu/ml)，于25℃环境中静置15min。分别于第1h、2h、4h和8h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
[0046]
结果如图4所示，溶藻弧菌噬菌体gva-p21在ph为5-10范围内处理8h其效价无明显变化，ph为3-12处理1h后仍具有较高效价，ph为4-11处理2h后效价仍较高。
[0047]
实施例5：
[0048]
溶藻弧菌噬菌体gva-p21的温度稳定性试验
[0049]
取若干支无菌50ml离心管，各加入45ml tsb后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5ml噬菌体纯培养液(起始效价：3.21
×
108pfu/ml)，于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃的温度中作用1h、24h、48h、1w、4w、8w、12w、24w和48w。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
[0050]
结果如图5所示，实验组中溶藻弧菌噬菌体gva-p2在温度为65℃以下较易存活，在4-37℃具有良好的稳定性，可长期保存。
[0051]
实施例6：
[0052]
溶藻弧菌噬菌体gva-p21的发酵制备
[0053]
从宿主菌溶藻弧菌gva1平板上挑取单菌落，接种于3ml的2％氯化钠tsb培养基中，在37℃下150rpm/min培养8h，得到宿主菌液。将菌悬液以1％接种量接种于100ml的2％氯化钠tsb培养基中，在37℃下150rpm/min培养至对数期前期。发酵体系为6l，发酵培养基为普通tsb培养基，初始ph值为7.0；采用火焰法按1％接种量接种溶藻弧菌，以最佳感染复数moi＝0.01向发酵体系加入噬菌体，接入噬菌体后需静止吸附15min，发酵过程中通入无菌空气，并加入3
‰
消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样
口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
[0054]
由图6可知，溶藻弧菌噬菌体gva-p21在发酵6h时，效价达到最高，为7.69
×
10
10
pfu/ml，在6h至12h时间段，效价稳定在10
10
pfu/ml；因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。
[0055]
实施例7
[0056]
噬菌体gva-p21与vapl1对溶藻弧菌的动态抑菌实验，实验设置如下：
[0057]
(1)准备好噬菌体gva-p21(5
×
107pfu/ml)与vapl1(5
×
107pfu/ml)种子液；
[0058]
(2)将宿主溶藻弧菌接种于装有2％氯化钠tsb培养基中，待宿主菌od
600
值到0.6左右时，按1:100比例转接宿主菌菌液于2％氯化钠tsb培养基中，同时加入培养液体积量1％的噬菌体，静止15min；另外设置宿主溶藻弧菌对照组；
[0059]
(3)静止结束后，统一放入恒温培养箱中培养，设置条件为37℃、150rpm/min；在培养时间为0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、24h、36h和48h时检测菌液od
600
值，并记录数据与分析。
[0060]
实验结果如图7所示，噬菌体gva-p21具有优秀的抑菌表现，抑菌时长可达24h，与噬菌体vapl1相比，具有明显、直观的抑菌效果，在24h时，噬菌体gva-p21将溶藻弧菌od
600
抑制在0.2以内，噬菌体vapl1组的溶藻弧菌od
600
到达1.1，浓度相差5倍；与空白组相比，噬菌体gva-p21组比gva1组下降4.5倍左右，抑菌效果明显。
[0061]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0062]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
技术特征：1.一株分离的溶藻弧菌噬菌体(vibrio alginolyticus phage)，其特征在于，其保藏编号为cctcc no：m 20211480，命名为gva-p21。2.权利要求1所述溶藻弧菌噬菌体(vibrio alginolyticus phage)的应用，其特征在于，应用于抑菌。
技术总结本发明提供一株高发酵率、抑菌持久的溶藻弧菌噬菌体GVA-P21及其应用，所述溶藻弧菌噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M20211480，命名为GVA-P21，本发明中的溶藻弧菌噬菌体GVA-P21发酵效率高，在MOI＝0.01时，培养6h效价达到8.24
技术研发人员：王喜亮 黄金梅 田甲 张秀玲 徐岳 张晓东 李越 胡雄
受保护的技术使用者：武汉格瑞农生物科技有限公司
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2022/7/5
